Hydrophobe Wechselwirkung oder Umkehrphasenchromatographie

Julika Drechsler Oktober 2, 2017 Wissenschaft 9 1
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Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder Umkehrphasenchromatographie ist eine Technik, um Komponenten in einer Lösung zu trennen. Die Theorie dahinter ist, dass verschiedene Substanzen verschiedene hydrophobe Eigenschaften haben. Dazu wird eine Säule verwendet wird, mit einer hydrophoben Substanz gefüllt. Substanzen, die hydrophober sind länger klebte an der Säule und damit mehr von der Säule zu eluieren bleiben. In diesem Artikel gehen wir von einem Proteingemisch.

Inhaltsverzeichnis

Der hydrophoben Interaktionschromatographie, der auch als Chromatographie bekannt sind, können verwendet werden, um viele verschiedene Stoffe voneinander zu trennen. Diese Technik wird üblicherweise zur getrennten Proteine ​​in Mischungen miteinander verwendet. Als ein Beispiel einer Art von Protein aus einer Zelle zu erhalten und zu studieren, kann man einfach nicht mehr aus. Dies erfordert nachfolgenden Reinigungsschritte, bis es hält lediglich über das gewünschte Protein.
  • Das Butyl-Säule
  • Die Akta Reiniger
  • Die verwendeten Puffer
  • Die Proteinreinigung, die Gradienten
  • Die Theorie des Reinigungs
  • Überprüfen der Reinigungs

Das Butyl-Säule

Das Protein zu trennende Gemisch über eine Butyl-Säule geleitet werden. Butyl sehr häufig als Trennmaterial verwendet wird, aber auch Phenyl und Octyl Säulen verwendet. Das Butyl-Säule werden die Proteine ​​gemäß Hydrophobie zu trennen. Proteine, die hydrophobe Wechselwirkungen mit der Säule werden länger auf der Säule als andere hydrophiler Proteine ​​bleiben. Dieses Prinzip der Trennung wird auch als ?? ?? Umkehrphasenchromatographie bezeichnet. Dies liegt daran, dass die stationäre Phase zu Beginn der Chromatographie war aufgrund der hydrophilen polaren Charakter der Kieselsäure verwendet, so dass hydrophobe Komponenten zuerst eluiert, so daß normalerweise ?? wenn ?? Hinsicht war. Die Einführung von Alkyl-Gruppen) betrug die stationäre Phase hydrophob ist, so daß hydrophile Komponenten werden zuerst eluiert, wodurch ?? ?? umgekehrt.

Die AKTA explorer

Das Butyl-Säule ist mit einer Äkta Explorer verbunden. Diese Maschine wird die Säule unter hohem Druck zu bringen, so dass die Reinigung besser, schneller und mit höherer Auflösung werden. Es wird von GE Healthcare Wissenschaft hergestellt
Dieser Hersteller hat auch andere Systeme, die einen Forscher helfen, auf seinen Proteinreinigungen.

Die verwendeten Puffer

Die Puffer
Es gibt zwei Puffer in diesem Proteintrennung verwendet.
  • Puffer A aus Tris-Puffer, Ammoniumsulfat und PMSF besteht.
  • Puffer B hat die gleichen Bestandteile, nach dem AS. Der Grund dafür wird nachstehend erläutert.

Beide Puffer wurden zunächst durch ein Mikroporenfilter zuvor um Staub und andere kleine Teilchen, die möglicherweise die Säule verstopfen würde, entfernt werden kann.
Die Zutaten
  • Tris dient als pH-Puffer. Es hat einen pKa von 8,1 und eine wirksame puffernde Bereich von pH 7,2 bis pH 9 Puffer A wurde unter Verwendung von NaOH und HCl auf einen pH von 8 eingestellt hergestellt.
  • PMSF ist ein Serinprotease-Inhibitor, in Konzentrationen zwischen 0,1 und 1 mm eingesetzt. Es ist auf die Zwischenablage an Serinproteasen, die auch gefunden werden, um in der Mischung verhindert werden, so dass sie zu untersuchen kann das Protein nicht abbauen zugegeben. Dies, da die Proteine ​​wurden durch Lyse der Zellen in Frage erhalten. Serinproteasen sind Endopeptidasen mit einer charakteristischen Serinrest im aktiven Zentrum. Die Halbwertszeit von PMSF in Wasser beträgt nur 35 Minuten bei pH 8, aber dies ist völlig ausreichend um die Protease zu inhibieren, wenn überhaupt, während der Periode, die Proteinmischung ist nicht auf Eis, mit anderen Worten, während der Reinigung.
  • AS ist ein Salz, und wird verwendet, um zu erhalten, sogenannte Aussalzen. Das AS geht zu den Proteinen in Konkurrenz für Wassermoleküle, so daß bei steigenden Konzentrationen des Proteins in Lösung, wird mehr und mehr von AS ausgetauscht werden. Das Protein wird sozusagen aus dem Wasser durch AS gejagt werden.

Die Proteinreinigung, die Gradienten

Die Säule nach dem Waschen der AKTA Explorer und die Spalte ist, bedeutet dies mit Puffer A äquilibriert daß die AKTA Explorer 100% Puffer A bewirkt die Spalte. Danach wird die Probe auf die Säule geladen. Wegen der hohen Konzentration von As auf der Säule werden die Proteine ​​aus der Lösung getrieben werden, und mit hydrophoben Wechselwirkungen, die Butyl-Säule zu befestigen.
Wenn die gesamte Probe auf die Säule wurde zuerst gesetzt, gibt es eine Anzahl von Säulenvolumina Puffer A, über die Säule geführt, so daß nicht intragerende Proteine ​​der Säule gespült werden. Danach wird es auf 100% Puffer B bei einer Frist von etwa 30-40 Minuten Belastungen einwirken eines Gradienten von 100% Puffer A. Dieses Prinzip ist als Gradientenelution bekannt. Die Salzkonzentration wird daher fortlaufend ändern steigt in diesem Fall, die im allgemeinen ergibt eine bessere Trennung von Proteinen als beim Hinzufügen der zweiten Pufferstufen.

Die Theorie des Reinigungs

Die Konzentration der Lösung, die aus dem System strömt, ist jederzeit gegeben als:
= -f
Wobei die Konzentration der Lösung, die aus dem System ausgeführt wird, die Ausgangskonzentration des Puffers A, die Ausgangskonzentration des Puffers B und f die Restfraktion ist die Summe aus den ursprünglichen Volumina der beiden Puffer.
Je länger die Retentionszeit, desto höher wird die Auflösung theoretisch sein, aber eine Zeit von 30 Minuten durchführbar und ergibt eine ausreichend gute Trennung. Die Steigung wird sichergestellt, dass die Konzentration von As verlangsamt, so dass die am stärksten hydrophil Proteine ​​langsam aus der Säule zu eluieren. Bei zunehmender Konzentration B, wird auch die hydrophoberen Proteinen in Lösung sein, da sie in Konkurrenz mit den Salzionen nicht mehr. Durch Fraktionierung wird das Protein in epjes gesammelt. In jedem epje wird 1 ml Laufmittel aufgefangen.
Die Trennung wird durch UV-Absorption überwacht. Peptidbindungen absorbieren UV-Strahlung mit einer Wellenlänge von 220 nm. Der höchste Gipfel im Chromatogramm der Test overgeëxpresseerde Protein, da eine höhere Peak entspricht mehr Protein, und wir erwarten, dass die overgeëxpresseerde Protein als in hohen Konzentrationen vorhanden ist. Die Fraktionen, die diesem Peak enthalten daher das Protein untersucht werden.

Überprüfen der Reinigungs

Die Fraktionen, die am Rand des Spitzen wird auf einem SDS-PAGE-Gel geladen werden, um die Fraktionen zu wenig gewünschtes Protein und zu viele Verunreinigungen enthalten nicht mehr in alle nachfolgenden Reinigungsschritte durchzuführen, und die Fraktionen, die ausreichend Protein enthalten zurückzuhalten . Nach dieser Entscheidung werden die Fraktionen wieder für den nächsten Reinigungsschritt gepoolt.
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Kommentare (1)
Marin Tetzner
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Es ist bekannt über die Trennung von Lactose aus Milch unter Verwendung eine chromatographische Prozess?

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